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　　對于ELISA試劑盒實驗新手來說，實驗中遇到的一些棘手的問題便無從下手，天津本生小編列出了ELISA試劑盒實驗中一些常見的問題以及解決方法，希望對您有所幫助：

　　問題序號可能原因解決方法顯色淡，靈敏度偏低

　　1 試劑盒未充分平衡試劑盒從2～8℃冰箱取出后打開盒蓋，于室溫平衡至少20分鐘，確保所有試劑已平衡至室溫(約25℃)

　　2 樣品不適合做ELISA檢測樣品一般選擇培養上清、血清、血漿。其他樣品形式可能不適合做ELISA檢測或者需要優化檢測的條件(例如稀釋液的成分)

　　3 酶標板在貯存或洗后拍干時過分干燥防止板過于干燥

　　4 包被抗體遭到破壞操作溫和，移液槍不能碰到孔底

　　5 樣本和抗體孵育條件不合適按照說明書條件，建議孵育過程中全程振蕩孵育。

　　6 洗滌浸泡時間過長按照說明書操作。勿人為增加浸泡時間;

　　7 偶聯HRP試劑污染棄去試劑，重新配置

　　8 錯誤的稀釋偶聯HRP試劑棄去試劑，重新配置

　　9 TMB底物孵育時間過短，因非人為因素影響，需要優化孵育時間確定合適的孵育時間：人為判定-濃度的標準品出現深藍色;S4-5有淡藍色;機器判定620 nm波長下測定OD值達到0.6-0.65

　　10 樣本濃度過高或存在基質效應建議做不同稀釋倍數，確認樣本合適的稀釋倍數。

　　11 酶標儀濾光片設置有問題或者波長選擇不對確認儀器設置及選擇正確的波長檢測。

　　12 酶標板不適合做ELISA不能使用細胞培養板，建議使用ELISA用高吸附力板子。

　　背景深，全部呈有色(通常的Elisa背景值OD<0.2)

　　1 洗滌不充分，洗后未拍干，樣品中其它成分殘留或酶標記物殘留洗液準確配制;充分洗滌，靜置15，拍干。加樣或加酶拍板的濾紙應棄去不用，不要反復使用，否則易造成污染。

　　2 底物污染，未避光保存，出現顏色棄去底物，重新配置

　　3 樣品稀釋液污染棄去稀釋液，重新配置

　　4 吸頭重復使用，未洗凈或消毒不吸頭盡可能一次性使用

　　5 不正確的孵育時間，溫度(尤其是底物孵育的時間)為常用的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2～8℃。按照說明書要求。

　　6 偶聯抗體濃度過高按照說明書調整到合適的濃度

　　7 ELISA板子不正確的貯存酶標板貯存于2-8 ℃;使用結合力低點的Elisa板8 沒有正確封閉在標準品稀釋液中加入動物蛋白或延長封閉時間

　　9 樣本溶血嚴重建議使用非溶血或輕微溶血樣本，嚴重溶血樣本會導致背景偏高。

　　重復性不佳，高CV值

　　1 樣品不均一加樣充分混勻樣品，取樣確保移液位置一致;

　　2 包被板表面遭到破壞洗板加樣時盡量小心，避免破壞板的包被表面

　　3 孔與孔之間的交叉污染孵育后取下蓋子小心操作，避免孔與孔的污染;封板膜不能重復使用

　　4 加樣量不一致樣品稀釋應充分混勻，盡可能使用同一移液器并裝緊吸嘴

　　5 邊緣效應(外周孔顯色較中心孔深)孵育時盡量100 rpm旋轉混勻

　　6 微量加樣不準確微量加樣的準確性和均一性

　　7 不正確的洗滌洗液準確配制;充分洗滌，靜置15，確定每一步的洗滌出現白板

　　陽性對照不顯色

　　1 顯色液變質更換新的顯色液

　　2 洗滌液配制有誤請按說明書所示稀釋倍數配制3 未加酶結合物而認為已加入注意不要漏加

　　4 終止液誤作洗滌液稀釋或當底物液使用每次加液均應看清標簽

　　5 標準品稀釋方法錯誤/或標準品有問題請按照說明書所示配置說明書，注意單位和稀釋倍數

　　6 不同試劑盒或不同批號的試劑混用建議使用同批次試劑盒。不能混用不同試劑盒或不同批號的試劑。

　　不正常的標準曲線

　　1 錯誤的方法重懸標準品 加入正確量的溶液重懸標準品，重懸充分

　　2 標準品稀釋錯誤 按照說明書要求稀釋標準品

　　3 標準品污染 使用一次性的滅菌吸頭，標準品貯存于2-8 ℃

　　4 錯誤的倍比稀釋步驟 按照說明書倍比稀釋標準品

　　5 波長選擇錯誤TMB為底物和以OPD為底物的試劑盒均有使用，而 者比色波長為450nm，后者為492nm。雙波長比色分析優于單波長。

　　6 標準品混用 不同批號試劑勿混用

　　7 試劑盒在運輸途中時間太長，溫度太高，標準品失活 盡量縮短運輸時間，夏季應放冰塊降溫

　　8 ELISA未終止而直接檢測450nm和620nmTMB顯色需終止后檢測，否則會出現620nm比450nm讀數高的現象。

　　樣品或標準品OD超出正常范圍

　　1 錯誤的樣品或標準品的稀釋 按照說明書稀釋2 偶聯抗體濃度過高 按照說明書調整到合適的濃度3 TMB底物孵育時間過長 調整到合適的孵育時間4 樣品或標準品污染 避免污染5 錯誤的孵育時間或溫度 按照說明書6 孵育時未加蓋導致溶液揮發和污染 貼封片或加蓋標曲很好，但是樣本無法計算到數值1 標曲選擇不合適選擇合適的標曲擬合;

　　2 樣本含量很低，低于靈敏度無法被檢測到嘗試濃縮樣本或使用高敏ELISA試劑盒檢測3樣本含量很高，超過標曲建議進行預實驗摸索稀釋倍數，確保樣本OD值落在標曲范圍內標曲高濃度間無明顯趨勢1如OD絕對值靠譜，但是僅無梯度，則顯色過度TMB顯色體系中建議根據S1，S2顏色進行判斷，當S1，S2深藍色，有明顯梯度，S5有淡藍色時即可終止。

　　注：此產品供科研使用，以上資料供參考!

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